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1、外源DNA片段成功插到載體里面（PCR鑒定），但無法表達蛋白
一般判斷目的基因是否表達，首先要進行SDS-PAGE檢測。跑膠的時候一定要設(shè)對照：Marker，標準品陽性對照，以及空白載體(誘導(dǎo))和重組載體(不誘導(dǎo))2個陰性對照，再加上誘導(dǎo)不同時間的表達結(jié)果。跑SDS-PAGE的話可以用考馬斯亮蘭染，它靈敏度在100ng左右；但是不能跟著做westernblot了。銀染的靈敏度在0.1～1ng；或是SyproRed，靈敏度高還可以繼續(xù)做Westernblot。
在做過WesternBlot仍沒有檢測到表達帶，那么就要先判斷載體的多克隆位點和片斷插入的序列，是否有因為酶切連接而意外引入了轉(zhuǎn)錄終止信號。其次要對測序結(jié)果進行確定，確定插入的每個堿基都是正確的，沒有意外終止的情況。zui后，也需要注意基因中是否有稀有密碼子，可更換表達菌株。
每種菌株都有自己*的設(shè)計，或者是蛋白酶缺陷，或者是重組酶缺陷，改造的目的都是為了讓質(zhì)粒在細菌中存在更穩(wěn)定，表達的產(chǎn)物不易被降解。不同的載體要配合一定的菌株使用，像pET系列就一定需要有T7RNA聚合酶片段整合在細菌中的菌株才可用于表達。采用不同調(diào)控機制會使用不同的表達菌株，所以換菌株一定要仔細看過載體的調(diào)控方式再換。例如，使用BL21(DE3)菌株表達不成功可以嘗試用Rosetta系列菌株表達，它能夠由一種氯霉素抗性的、與pET相容的質(zhì)粒提供AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA的tRNA。所以這類菌株能夠明顯改善大腸桿菌中由于稀有密碼子造成的表達限制。有時不明原因的表達蛋白截短(比預(yù)期的分子量要小很多)也可能是由于稀有密碼子造成的。
沒有發(fā)現(xiàn)原則性錯誤之后，可以從表達條件入手，梯度條件改變表達溫度、IPTG濃度，低溫、較長時間的表達有利于蛋白穩(wěn)定、融合表達；低濃度的IPTG可以減少化學(xué)物質(zhì)對細胞的損傷。而且培養(yǎng)基中的葡萄糖可能會抑制表達。導(dǎo)致表達的蛋白與預(yù)期的不同。如果嘗試改變條件后依然沒有表達，可以試試換不同的培養(yǎng)基（如LB、TB、M9等）。
如果以上方法均無法表達出目的蛋白，可更換載體-表達系統(tǒng)。在換過不同載體，不同菌株之后仍是表達不出來的話，可以嘗試其它的表達系統(tǒng)，因為有些蛋白是在大腸桿菌表達系統(tǒng)中無法表達。
蛋白表達出來了，但是跑SDS-PAGE時大小不符?
SDS-PAGE時蛋白的凈電荷會影響遷移率。帶電量高的蛋白會結(jié)合較少的SDS，阻礙蛋白的泳動。富含脯氨酸的蛋白會在SDS-PAGE膠中移動得特別慢。如果蛋白的等電點在5~9之間，并且組成的氨基酸組分沒有明顯的偏好，那么目的蛋白遷移率與預(yù)期相差較遠就很有可能不是由于凝膠電泳造成的，可能是稀有密碼子造成表達產(chǎn)物的截短。利用C端或者N端的標簽進行WesternBlot，看是否由于蛋白被蛋白酶降解而導(dǎo)致多條目的條帶或者比預(yù)期小很多的條帶出現(xiàn)。
重組表達的蛋白為不可溶包涵體
大多數(shù)在大腸桿菌中表達的外源蛋白都是以包涵體形式存在。一般情況下，形成包涵體表達產(chǎn)率都很高，并且容易分離，得到比較純的包含體。包涵體致密的結(jié)構(gòu)有助于防止蛋白酶對它的降解作用，如果毒性較強的蛋白形成包涵體也就不會對細胞產(chǎn)生太大的損傷。如果表達蛋白的目的是為了作為抗原制備抗體，那么可以用PBS將包涵體懸浮，使用佐劑將溶液乳化后注射進入動物體內(nèi)進行免疫。包含體的形成據(jù)分析原因之一在于表達量過高，表達產(chǎn)物來不及折疊為活性形式——多數(shù)以高表達見長的表達系統(tǒng)都會得到包含體產(chǎn)物。如果融合表達含有標簽，常用的做法是將包涵體用尿素溶解后在變性的情況下進行純化，然后復(fù)性。
如何獲取可溶性蛋白
如果需要獲得具有一定活性的表達蛋白，那么讓蛋白可溶形式表達，避免包涵體形成。避免包涵體的方法很多，比如：選用表達量不高的表達系統(tǒng)，選擇有助于可溶性表達的融合表達系統(tǒng)比如pThio，pMal等等，對于T7系統(tǒng)來說降低或者減少誘導(dǎo)條件(例如降低ITPG濃度減少T7聚合酶)從而降低表達速度，使用基本培養(yǎng)基等也有助于可溶性表達。另外一個容易忽視的問題是大腸桿菌內(nèi)還原性過高會導(dǎo)致二硫鍵不能正確形成，同樣容易導(dǎo)致表達產(chǎn)物不溶，更換菌株例如Novagen的Origami系列也有助于解決這個問題。還有一種方法是當?shù)鞍讙煸谥由系臅r候，在還原和氧化的谷胱甘肽存在的情況下用濃度從6M到0M的鹽酸胍過柱，促使蛋白的折疊。在蛋白重新折疊后用咪唑洗脫。德泰的上清蛋白表達服務(wù)通過條件矩陣正交優(yōu)化的方法，使重組蛋白表達在上清液中，即獲得具有相當活性的表達蛋白
切除標簽時引入的蛋白酶是否一定要切除?
很多時候我們要用蛋白酶除去加入的標簽，在蛋白酶切除標簽后是否一定要去除呢?有人認為蛋白酶與目的蛋白加入的比例是1:500甚至更低，蛋白酶是不會影響到下一步操作的，在一些粗放的生化實驗不用去處蛋白酶。嚴謹?shù)暮罄^實驗需要將蛋白酶除去。很多公司已經(jīng)開發(fā)出帶有標簽的蛋白酶，使得僅通過過親和柱就可以方便的去除蛋白酶和融合標簽。Tag-Free技術(shù)與傳統(tǒng)的標簽切除技術(shù)不同，不存在蛋白酶引入導(dǎo)致雜蛋白影響的情況，具體對比如下：
| 標簽蛋白 | 無標簽蛋白 | |
| 對蛋白結(jié)構(gòu)功能影響 | 較長的標簽有可能限制重組蛋白折疊，影響蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能 | 無標簽蛋白氨基酸序列與天然蛋白氨基酸序列基本相同，更接近天然蛋白的結(jié)構(gòu)免疫原性較易產(chǎn)生非特異性抗體，影響抗體制備保持蛋白抗原的天然結(jié)構(gòu)。 |
| 免疫原性 | 較易產(chǎn)生非特異性抗體，影響抗體制備 | 保持蛋白抗原的天然結(jié)構(gòu)。 |
| 蛋白結(jié)晶與X射線結(jié) 構(gòu)解析 | 額外的標簽氨基酸可能造成晶體結(jié)構(gòu)改變，影響功能結(jié)構(gòu)分析 | 無額外的標簽氨基酸更接近天然蛋白的構(gòu)象，更易結(jié)晶 |
| FDA藥檢審批 | 通常因含有額外引入的氨基酸，與天然蛋白序列存在差異，所以不易通過審核 | 與天然蛋白序列一致，易通過審核 |
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