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實(shí)驗(yàn)材料和方法
從1968年 zui早的商品化 流式細(xì)胞術(shù)(FC) 和熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)誕生以來(lái), 它們已得到大大改進(jìn)。但要成為實(shí)驗(yàn)室廣泛接受的技術(shù)，除成本因素外，還存在不少障礙。技術(shù)上的問(wèn)題主要是細(xì)胞內(nèi)低豐度分子的檢測(cè)，缺少“通用”細(xì)胞通透物 質(zhì)，細(xì)胞自發(fā)熒光的干擾效應(yīng)，熒光分子間發(fā)射光譜的重疊，以及缺少可識(shí)別目標(biāo)分子的試劑。特別是對(duì)于細(xì)胞分揀來(lái)說(shuō)，由于液滴的形成收集、分揀細(xì)胞重分析或 培養(yǎng)前的稀釋，以及為獲得足夠數(shù)量的可用細(xì)胞需要的時(shí)間延誤的原因，還存在細(xì)胞存活問(wèn)題。zui后，特別是在處理低豐度對(duì)象時(shí)，數(shù)據(jù)分析也是很棘手的。
有一篇關(guān)于 流式細(xì)胞儀理論的不錯(cuò)的綜述，介紹了流式細(xì)胞儀的操作語(yǔ)言。此外，還有另一篇文章涵蓋了提供流式細(xì)胞儀所用特定試劑的 主要抗體供應(yīng)商。本文將聚焦于以下幾點(diǎn)：
1）硬件的選擇和注意事項(xiàng)
2）流式細(xì)胞儀和細(xì)胞分選的實(shí)際問(wèn)題
3）數(shù)據(jù)分析和軟件。這幾個(gè)話題包含的內(nèi)容不展開論述
希望讀者在著手開展表1列出的一些流式細(xì)胞儀應(yīng)用研究前，了解一些注意事項(xiàng)。
| 應(yīng)用 | 細(xì)胞表面 | 細(xì)胞內(nèi) | 分揀 |
| 免疫反應(yīng) | 是 | 是 | 是 |
| 細(xì)胞凋亡&壞死 | 是 | 是 | O |
| Cell therapy | 是 | 否 | 是 |
| 信號(hào)傳導(dǎo)/ 激酶活性 | 是 | 是 | 是 |
| 細(xì)胞周期分析 | O | 是 | 是 |
| 可溶性蛋白定量 | 是 | 否 | 否 |
| 細(xì)胞器分析 | O | 是 | 是 |
| 胚胎& 多能干細(xì)胞 | 是 | O | 是 |
| 基因組分析 | 是 | 是 | O |
| 細(xì)菌分析 | 是 | 是 | 是 |
| 環(huán)境微生物分析 | 是 | O | 是 |
| 微藻/浮游生物種群和群落 | 是 | O | 是 |
| 表達(dá)載體效率 | O | 是 | 是 |
| 受體藥理學(xué) | 是 | 是 | 是 |
| 細(xì)胞衰老 | 是 | 是 | 是 |
| Sperm physiology and sexing | 是 | 否 | 是 |
| 癌癥干細(xì)胞分析 | 是 | 是 | 是 |
| 病理學(xué) - 疾病鑒別 | 是 | 是 | O |
| 產(chǎn)前診斷 | 是 | 是 | O |
| 癌癥診斷 | 是 | 是 | O |
| 遺傳性疾病診斷 | 是 | 是 | 是 |
| 循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞和前體 | 是 | O | O |
| 基因表達(dá) | 是 | 是 | 是 |
| 病毒感染 | 是 | 是 | 是 |
| 食品安全 | 是 | O | 否 |
| 突變 | O | 是 | 是 |
| 毒理學(xué)和誘變 | O | 是 | O |
| 染色體分揀 | O | 是 | 是 |
| HLA分型 | 是 | 否 | 否 |
| 異種移植監(jiān)測(cè) | 是 | O | 是 |
| 細(xì)胞離子通量 | 是 | 是 | O |
| 高通量檢測(cè) | 是 | 是 | O |
| 細(xì)胞克隆 | 是 | 否 | 是 |
| 細(xì)胞分裂和遷移(CFSE) | 是 | 是 | O |
表1. 流式細(xì)胞儀和/或細(xì)胞分揀的常見應(yīng)用
硬件
在決定需要什么實(shí)驗(yàn)設(shè)備的時(shí)候，細(xì)胞生物學(xué)家需要了解自己的預(yù)計(jì)需求和預(yù)算。表2列出了市場(chǎng)上可有的選擇。由于這些設(shè)備會(huì)不斷更新，建議到制造商查詢。
| 細(xì)胞分揀設(shè)備 | |
| JSAN® / Bay Biosciences® | Benchtop Asian Co. |
| BD® / FACS Calibur / Aria | Also clinical instruments |
| Beckman Coulter® / MoFlo® | Also clinical instruments |
| Cytonome® | Closed Cartridge |
| Influx / BD® | Large Particle |
| Micromet AG | Acquired by Amgen 3/12 |
| Owl / Innovative Micro Technologies | Microfluidic cartridges |
| Partec | Bench top |
| Sony® / iCyt | Start-Up |
| Union Biometrica® | Large Particle |
| 流式細(xì)胞儀（分析級(jí)） | |
| Accuri®/ BD® | Bench top to multi-laser |
| Attune / Life Technologies® | Acoustic focusing |
| Apogee | Small particle focus |
| Guava / Millipore® | Microcapillary |
| Gallios / Beckman Coulter® | Multi - laser |
| Stratedigm | Iso-Pressure Fluidics |
| 競(jìng)爭(zhēng)技術(shù) | |
| Amnis | Imaging Cytometry |
| DVS Sciences®/CyTOF | Mass Spec discrimination |
| Miltenyi and others | Magnetic Beads |
表 2. 主要設(shè)備供應(yīng)商
做小顆粒分析的專業(yè)公司（JSAN, Partec, Accuri）將他們的服務(wù)定位于個(gè)體實(shí)驗(yàn)室或需對(duì)其細(xì)胞分揀儀做恒定質(zhì)量分析的實(shí)驗(yàn)室。他們通常會(huì)用到改進(jìn)的更小的激光二極管和微流體。但如果需要做每 日監(jiān)控或者對(duì)大型項(xiàng)目（如臨床試驗(yàn)）的多臺(tái)儀器的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，其軟件沒(méi)有大公司的強(qiáng)大。一個(gè)建議是確保儀器輸出文件能夠同您打算使用的收集后分析軟件兼 容。
研究人員對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行了分類，超大型（浮游生物、母細(xì)胞、早期胚胎），非常小（微粒、細(xì)菌）或者高度不對(duì)稱（精子、肌小管）。確保您將要使用的儀器以前在這一應(yīng)用中被成功使用過(guò)。噴嘴直徑、流動(dòng)細(xì)胞的幾何形狀、流速、液滴大小、檢測(cè)器位置都會(huì)影響到結(jié)果。
再生醫(yī)學(xué)和癌癥治療研究通常要求對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離以確保純度、細(xì)胞活力，并且便于在流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)室和病人間運(yùn)送。Closed cartridges (Owl，Cytonome公司) 似乎是制造商為解決這一問(wèn)題的一個(gè)嘗試。另一個(gè)途徑是提供帶有無(wú)菌罩或者可匹配標(biāo)準(zhǔn)尺寸無(wú)菌罩的細(xì)胞分揀儀。
有幾種可增強(qiáng)流體流動(dòng)的技術(shù)，如聲學(xué)對(duì)焦 (Life Technologies公司)、等壓射流 (Stratedigm公司)、毛細(xì)管(Millipore公司)，或微流控技術(shù)（幾個(gè)還在開發(fā)中）。它們大多已在其他設(shè)備上應(yīng)用，卻未必已用于流式細(xì)胞 儀。為便于使用者獲得及時(shí)反饋，我建議本文讀者加入 普渡大學(xué)流式細(xì)胞儀訂閱。許多流式細(xì)胞儀方面的人物都會(huì)定期在該論壇上提供有價(jià)值的信息。其他博客，比如Google+，也有類似功能，但它們?nèi)狈ζ斩蓤F(tuán)隊(duì)的深度和廣度。
另外，還有一些有意思的技術(shù)在這一領(lǐng)域也很有影響。首先，利用Miltenyi或其他公司的磁珠對(duì)目的細(xì)胞做預(yù)純化或清洗可提高分揀效率。當(dāng)然，僅僅利 用一輪或多輪磁珠篩選而不用流式細(xì)胞儀，許多研究也能開展起來(lái)，但這不是本文討論的重點(diǎn)。Amnis 公司已將流式細(xì)胞儀射流與熒光顯微鏡和數(shù)字成像整合在一起。其結(jié)果是一系列單個(gè)細(xì)胞的圖像能夠顯示熒光團(tuán)的分布，而非簡(jiǎn)單的平均熒光指數(shù)（MFI）。 DVS Sciences已極大地?cái)U(kuò)展了可用質(zhì)譜（MS）檢測(cè)結(jié)合報(bào)告抗體的金屬螯合物的靶標(biāo)數(shù)。目前有33種不同的金屬可被同時(shí)檢測(cè)。該儀器被Time of Flight 稱為"Cytof" [1]。考慮購(gòu)買該儀器的研究人員應(yīng)該確保他們有這一深度的細(xì)胞分析需要。此外，細(xì)胞在等離子體中會(huì)被汽化，所以用于研究的細(xì)胞不能恢復(fù)。
細(xì)胞分揀儀制造商有一點(diǎn)不能達(dá)成共識(shí)，激光檢測(cè)是在細(xì)胞通過(guò)噴嘴后的液滴中（空氣中的蒸汽），還是液滴形成前的流動(dòng)細(xì)胞內(nèi)，完成效果好。如圖1， （上圖）一個(gè)蒸汽系統(tǒng)（Influx，也可能是FACSCalibur或其他設(shè)備），（下圖）一個(gè)流動(dòng)細(xì)胞系統(tǒng)（BD公司的 FACS Aria III）。
圖 1. 蒸汽的（頂部）和流動(dòng)的（底部）細(xì)胞分揀裝置的光學(xué)構(gòu)造。BD Biosciences®轉(zhuǎn)載許可。
這兩者各有優(yōu)勢(shì)和局限。蒸汽分揀儀硬件設(shè)備簡(jiǎn)單，檢測(cè)點(diǎn)與收集裝置間距離較短，檢測(cè)樣品的激光數(shù)多。而流動(dòng)細(xì)胞分揀系統(tǒng)通過(guò)比色皿提供層流和增強(qiáng)的樣品 聚焦。然而，流動(dòng)細(xì)胞長(zhǎng)度有限，而且激光光學(xué)裝置需要足夠空間避免不同通道間的串?dāng)_。對(duì)于敏感性來(lái)說(shuō)，流動(dòng)細(xì)胞系統(tǒng)明顯占優(yōu)，但蒸汽系統(tǒng)沒(méi)有保持細(xì)胞清潔 的問(wèn)題，并且能提供額外的激光束。需要指出的是，有些激光束本身對(duì)細(xì)胞有毒害作用。
細(xì)胞懸浮于液滴中，然后使其經(jīng)主脈沖自由下滴（或提供壓力）。有關(guān)液滴如何帶點(diǎn)和偏向的問(wèn)題，請(qǐng)參考Labome其他流式細(xì)胞儀的文章 圖7。
此外，關(guān)于培養(yǎng)基種類和細(xì)胞存活體積的問(wèn)題。相關(guān)文章和普渡大學(xué)有大量關(guān)于培養(yǎng)基的建議，但培養(yǎng)基通常會(huì)選用牛胎兒血清（FBS）。將細(xì)胞收集到 11 x 75 毫米或更大的管中，需要用到0.5 - 1 mL的牛胎兒血清。對(duì)于多層平板來(lái)說(shuō)，牛胎兒血清應(yīng)該占一半的體積，因?yàn)檫€要考慮平板干掉的問(wèn)題。而如果僅僅是收集核酸，用于細(xì)胞裂解和核酸提取的同樣的 產(chǎn)品就可以了。此外還建議對(duì)進(jìn)一步處理的細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)豐富的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)蘇。
所有的流式細(xì)胞儀制造商都在增加分揀細(xì)胞存活方面取得了很大的進(jìn)步。微流體方面的新進(jìn)展可能使不通過(guò)液滴形成做細(xì)胞收集成為現(xiàn)實(shí)。不管答案是否是毛細(xì)管-基礎(chǔ)系統(tǒng)或基于微通道的系統(tǒng)，都必將規(guī)避分揀時(shí)的細(xì)胞壓力問(wèn)題。
試劑-抗體
除非你用病人血清建立診斷檢測(cè)，不缺少提供流式細(xì)胞儀抗體的公司。請(qǐng)見Labome文章 列表。然而，并非所有這些公司都有相同克隆-并且不是所有克隆在流式細(xì)胞分析中作用方式相同。如果文章中沒(méi)有列出想要的克隆，而你又想運(yùn)行相似的實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)作者找出使用的哪一克隆。
多數(shù)公司不會(huì)公開抗體純化和標(biāo)記的方法，但如果你是從一個(gè)聲譽(yù)較好的公司購(gòu)買，同一克隆標(biāo)記相同的熒光基團(tuán)就可以了，除非是在發(fā)貨途中受損，微生物污染或者保存不當(dāng)。按照制造商建議的儲(chǔ)存條件，抗體至少能保質(zhì)一年。
然后，你應(yīng)該決定你的實(shí)驗(yàn)是否要用熒光直接標(biāo)記的抗體，或者用二抗，生物素-鏈霉親和素，或其他配體-受體。除非您的實(shí)驗(yàn)室預(yù)算緊張，應(yīng)使用直接標(biāo)記的抗體。直接標(biāo)記的抗體背景較低，沒(méi)有裂解細(xì)胞釋放的生物素造成干擾，重復(fù)性較好。
另一種選擇是用標(biāo)記試劑盒或者第三基團(tuán)標(biāo)記的抗體，如 SoluLink或其他的。一些抗體制造商也提供用戶定制標(biāo)記，但應(yīng)認(rèn)真考慮公司在抗體標(biāo)記方面的聲譽(yù)如何。所有的化學(xué)基團(tuán)各有優(yōu)劣，因此需要慎重考慮交聯(lián)劑（請(qǐng)見Thermo Fisher Pierce 實(shí)用指南。
有五種基本類型的熒光染料：小分子染料（如熒光異硫氰酸酯/ FITC和Alexa染料），蛋白染料（藻紅蛋白、別藻藍(lán)蛋白、綠色熒光蛋白），串聯(lián)染料，其中蛋白染料收集熒光，將它傳輸至小分子染料，然后串聯(lián)染料發(fā) 出同小分子染料（如APC-Cy7）量子點(diǎn)和多聚染料( 亮紫)相同波長(zhǎng)的光波。所有的都各有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，但蛋白染料和小分子染料在流式細(xì)胞儀中使用時(shí)間zui長(zhǎng)。
我們很容易就能觀察到標(biāo)記的大分子蛋白（> 100 kD）、疏水性染料或聚合物是如何改變單克隆抗體活性的。為說(shuō)明相對(duì)相對(duì)大小，圖2顯示了一個(gè)抗體分子與一個(gè)蛋白分子共軛的結(jié)構(gòu)（在這種情況下辣根過(guò)氧化 物酶“只有”44 kD）。我們可以得出這樣的結(jié)論：zui安全的方法是使用以前別人用過(guò)的同一克隆抗體和熒光染料結(jié)合的抗體。但是，我們?yōu)槭裁床荒軇?chuàng)造出一種*的抗體呢-通 過(guò)表達(dá)細(xì)胞或非表達(dá)細(xì)胞共軛組合并表征其特異性，然后滴定抗體zui大化其信噪比，這樣你的實(shí)驗(yàn)室就有一個(gè)新的試劑了。
圖 2.
試驗(yàn)中選擇熒光染料基于以下幾點(diǎn)：
1）流式細(xì)胞儀或細(xì)胞分揀儀上可以用什么樣的激光器和濾波器
2）目標(biāo)相對(duì)豐度-更亮的熒光染料應(yīng)該用在低豐度的分子上
3）靶標(biāo)是否在細(xì)胞內(nèi)。胞內(nèi)靶標(biāo)被包埋于細(xì)胞中，所以應(yīng)該使用zui亮的熒光染料兩種激光儀器，比如Guava? EasyCyte 或者BD? FACSCalibur 只能使用四種熒光染料，所以染料選擇就像設(shè)置一個(gè)可用熒光染料基質(zhì)并設(shè)其為檢測(cè)目標(biāo)一樣簡(jiǎn)單。PE通常是zui亮的，其次是APC，因此它們應(yīng)該被連接到胞內(nèi) 或低豐度的抗體上。想了解發(fā)射光溢出量，例如PE通道中的異硫氰酸熒光素，我們可以參考光譜分析 Invitrogen公司或者 BD公司。
如果超過(guò)兩種激光/四種顏色，我們就必須考慮自動(dòng)還是手動(dòng)補(bǔ)償了。 [2] [3] Fluorescence minus One (FMO)可以控制 [4] 分析儀器-特定波長(zhǎng)、強(qiáng)弱和熒光染料的重組。對(duì)于這些問(wèn)題，我建議閱讀相關(guān)文獻(xiàn)并咨詢您的流式核心管理層和內(nèi)部專家。
試劑 - 固定劑和通透緩沖液
使用的固定劑幾乎都是多聚甲醛、PFA或者甲醛。這三種名字的固定劑都會(huì)用到，但其活性成分是相同的。固定劑應(yīng)在磷酸鹽緩沖液（PBS）中稀釋至1-4%，固定過(guò)程通常在冰上進(jìn)行。如果是激酶或磷酸蛋白，其磷酸酶需要迅速失活，因此PFA通常在37℃下使用。
甲醛可與伯胺作用，因?yàn)榭贵w含有結(jié)合位點(diǎn)通常帶有靜電相互作用，賴氨酸固定修飾可避免抗體與固定蛋白結(jié)合。這也是為什么根據(jù)已有實(shí)驗(yàn)方案可以節(jié)省時(shí)間和 試劑的原因。顯然，固定（包括通透）會(huì)迅速殺死細(xì)胞，因此如果下一實(shí)驗(yàn)步驟是細(xì)胞分級(jí)分離或核酸提取，通常會(huì)先對(duì)固定細(xì)胞進(jìn)行分揀操作。
根據(jù)目標(biāo)抗體是否分泌并在高爾基體內(nèi)滯留，激酶或磷酸化蛋白是否需要磷酸酶抑制劑，核蛋白是否需要磷脂雙分子層部分溶解和DNA松弛，細(xì)胞透化需要選擇不同的方式。所有這些方法都會(huì)用到去污劑或酒精，去污劑zui溫和，而酒精特別是甲醇zui強(qiáng)效。
當(dāng)目標(biāo)在胞質(zhì)內(nèi)時(shí)，首先需要用到zui溫和的去污劑皂素。低濃度，通常0.1%的皂素，對(duì)胞內(nèi)細(xì)胞因子著色就足夠了 [5]。一些非離子去污劑，如Triton X-100、吐溫80也有使用，但皂素是zui常見的選擇。
對(duì)于激酶和磷酸化蛋白來(lái)說(shuō)，相關(guān)技術(shù)來(lái)自斯坦福大學(xué)的Gary Nolan 實(shí)驗(yàn)室 [6] [7]。磷酸酶被PFA和預(yù)冷酒精滅活，酒精也可以作為二次固定和強(qiáng)效通透的試劑。文章中建議70%-100%濃度的酒精，而70%和90%濃度的酒精zui常見。也有通透前先染色的例子。在去污劑和酒精中滴定抗體的-基于協(xié)議，可以在 Cytobank找到。分析深度的例子請(qǐng)見圖3。
圖 3. 典型的Cytobank數(shù)據(jù)庫(kù)熱圖
用甲醇或乙醇作為透化劑可以作用核內(nèi)目標(biāo)。乙醇對(duì)于擴(kuò)增細(xì)胞-特異性作用于Ki-67更好一些 [8]，但甲醇用的更多。并非所有抗體都結(jié)合PFA-甲醇固定細(xì)胞，因此許多單抗供貨商會(huì)提供一個(gè)相容性的表。然而，如果熒光劑是蛋白，在細(xì)胞用抗體染色前必須確保甲醇已經(jīng)去除干凈，因?yàn)楹芏嗟鞍讓?duì)醇類的脫水作用比較敏感。
醇類脫水作用的另一個(gè)受害者是那些細(xì)胞內(nèi)表達(dá)用于流式細(xì)胞分析的熒光蛋白。它們包括綠色熒光蛋白、mCherry和Cerulean3。如果熒光信號(hào)被醇類處理破壞，就需要用到熒光蛋白抗體來(lái)檢測(cè)變性熒光蛋白了。
試劑-染料
非結(jié)合染料在 早年是 *種用于流式細(xì)胞分析的細(xì)胞染色試劑。下面介紹的用到的染料可以分成活體染料（vital dyes）、核酸插入染料（nucleic acid intercalating dyes）、譜系染料（lineage dyes）、陽(yáng)離子和pH通道染料（cation and pH flux dyes）、外排染料（efflux dyes）和細(xì)胞器染料（organelle dyes）。只有zui常用的或者用到的染料才會(huì)被提及，如果想查看其他的來(lái)源，請(qǐng)參見 分子探針。備注：分子探針? 有15種染料。
活體染料
臺(tái)盼藍(lán)（Trypan Blue）是*種被發(fā)現(xiàn)不能進(jìn)入活細(xì)胞而能自由進(jìn)入死細(xì)胞的染料。PubMed上有一篇參考文獻(xiàn)提及它的使用可以追溯到1914年，*篇用于流式細(xì)胞 分析的文獻(xiàn)可以在上面Beckman Coulter鏈接中找到。而zui早將臺(tái)盼藍(lán)作為活體染料的文章可以追溯到1980年 [8]。從那以后，碘化丙啶（PI）和7-氨基放線菌素D（7-AAD）也被作為了活體染料的選擇 [9]。7-AAD在流式細(xì)胞分析中往往較少會(huì)外溢到臨近的通道中，因此明亮的DNA染料和另一種柔和的并且有重疊發(fā)射光譜的熒光分子一起使用的時(shí)候，一定要多加小心。
核酸插入染料
溴化乙錠(EtBr) 和碘化丙啶（PI）能夠結(jié)合到DNA雙螺旋的大溝。4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和Hoechst染料（有幾種常用的）則結(jié)合小溝。請(qǐng)注意， 一些染料 (例如碘化丙啶)也會(huì)結(jié)合到RNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)形成的溝中，因此如果要做DNA定量，需要用染料和RNA的混合液。其它染料，如7-AAD，不會(huì)與DNA大小 溝結(jié)合。
DNA 染料也用于細(xì)胞周期分析、染色體倍數(shù)分析和基因組大小量化。對(duì)于這些研究，通常會(huì)用到上面提到的DNA染料，但數(shù)據(jù)分析要求非常苛刻。幸運(yùn)的是，有一篇很好的文章詳細(xì)概述了這一過(guò)程 [10]。
細(xì)胞凋亡測(cè)定就用到了流式細(xì)胞儀的多個(gè)特性。與DNA結(jié)合而不透細(xì)胞膜的染料可用于鑒定晚期凋亡和壞死細(xì)胞。識(shí)別細(xì)胞周期蛋白（聚合酶的裂解結(jié)構(gòu)和磷酸化 組蛋白H3）的抗體都可以購(gòu)買到。zui早的細(xì)胞凋亡標(biāo)記是磷脂酰絲氨酸（PS）溢出，它通常只在細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)膜上存在。溢出被檢測(cè)到，卻并非用的抗體，而是通 過(guò)一個(gè)Ca2+依賴的結(jié)合蛋白，膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）。這一分子可以購(gòu)買到，通常連接幾種不同的熒光劑，它已經(jīng)成為研究細(xì)胞凋亡的支柱。膜聯(lián)蛋白V的詳細(xì)分析請(qǐng)參見 [10]。
譜系染料，例如羧基二醋酸琥珀酰亞胺酯（CFSE）利用膜滲透結(jié)合蛋白，然后通過(guò)琥珀酰亞胺酯與鄰近蛋白作用。一旦被染色，細(xì)胞經(jīng)過(guò)幾次分裂后仍然是染色狀態(tài)，因?yàn)楦?xì)胞分裂消耗的時(shí)間相比，蛋白質(zhì)的更新更緩慢。
陽(yáng)離子和pH通道染料
鈣離子(Ca2+)用Fura-2和Indo-1染料檢測(cè) [12]， 它們需要紫外線激發(fā)，因此許多流式細(xì)胞分析常用的染料在它們身上卻不能使用。Magnesium Green和 一些Fura-衍生物已經(jīng)被成功用到檢測(cè)Mg2+上 [13]。其中有些是在可見光譜中激發(fā)的。對(duì)pH值測(cè)定的熒光染料從1979年就開始使用了。要收集實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)，您的流式細(xì)胞儀要能顯示帶有時(shí)間軸的數(shù)據(jù)，收集率也必須在您想要測(cè)定的時(shí)候可以兼容多個(gè)樣品。
外排染料
幾種正常和轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠運(yùn)輸有機(jī)化合物到細(xì)胞外。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，這是極其重要的，從細(xì)胞中移除的分子可以作為化療藥物。然而，該轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程在正常細(xì)胞 中也能被發(fā)現(xiàn)，包括干細(xì)胞。一些外排的分子還具有熒光活性，有轉(zhuǎn)運(yùn)活性的細(xì)胞外觀不同，當(dāng)這些染料存在的時(shí)候，可通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分離。zui常用的染料是 Hoechst 33342，有轉(zhuǎn)運(yùn)活性的細(xì)胞被稱為“側(cè)群細(xì)胞”[14]。
細(xì)胞器染料
標(biāo)記細(xì)胞器的方法有三種。首先，可以用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，該載體上攜帶熒光蛋白基因，以及將蛋白質(zhì)同特定細(xì)胞器分離的足夠肽段信息。第二，有結(jié)合細(xì)胞器的 抗體 - 特異性標(biāo)志物，但它們需要細(xì)胞有通透性。染料往往使用簡(jiǎn)單，穩(wěn)定，熒光比多數(shù)熒光蛋白更明亮，一些可用于活細(xì)胞。Molecular Probes?提供多種染料，包括產(chǎn)品明細(xì)一個(gè)有用 。 一些常用的染料有：用于線粒體的紅色或綠色MitoTracker；用于氧化狀態(tài)線粒體的Dihydrorhodamine 123；LysoTracker Green和Lysosensor Green；用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的DIOC染料，以及作用于高爾基的BODIPY染料。
數(shù)據(jù)分析-軟件
軟件使得圍繞數(shù)據(jù)分析的問(wèn)題變得稍稍簡(jiǎn)單了，這也是本文這一部分要討論的主題。然而，大多數(shù)軟件以硬件的方式來(lái)匹配特定儀器的操作和數(shù)據(jù)分析。在眾 多廠商里，根據(jù)收集的信息是模擬的還是數(shù)字的，數(shù)據(jù)有很大的差異。慶幸的是，有一些不錯(cuò)的第三方軟件程序包，有一個(gè)甚至是免費(fèi)的，并且他們幾乎不受儀器限 制，能夠開展多數(shù)想要的數(shù)據(jù)分析。
即使考慮到以上所列的困難，我們?nèi)匀徊荒軐⒂眠@些儀器收集到的信息的廣度和深度細(xì)化為生物學(xué)或醫(yī)學(xué)的重要性的問(wèn)題。在( PubMed)搜索"flow cytometry" OR "FACS"的綜述文獻(xiàn)能找到許多這一話題的文章，其中這兩種方法中的一種或者兩種都有所使用。表I為通過(guò)這種方式找到的應(yīng)用列表。
應(yīng)使用流式細(xì)胞儀或細(xì)胞分揀儀自帶的軟件控制儀器，除非有令人信服的理由不要使用第三方軟件。通常這涉及到購(gòu)買儀器制造商不再支持的用過(guò)的儀器。多數(shù)機(jī)器 特定的軟件允許進(jìn)行一些分析。一臺(tái)雙激光臺(tái)式儀器可能沒(méi)有邊緣切割補(bǔ)償、標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)計(jì)軟件包。其次，有些軟件可能有大多數(shù)功能，但缺乏一個(gè)你需要的手稿或 演示文稿。第三，可能你的合作者有一臺(tái)不同的儀器，但你需要與他共享數(shù)據(jù)。zui后，你可能有數(shù)量有限的儀器軟件副本，但也有許多用戶想在他們自己的電腦上處 理數(shù)據(jù)，而不破壞原始數(shù)據(jù)。表III是主要的軟件套裝和它們應(yīng)用的儀器。
首先，需要考慮儀器的類型。較舊的儀器，如BD FACS Calibur和FACScan，將數(shù)據(jù)處理為模擬信息。較新的儀器，如目前市場(chǎng)上大部分儀器，將數(shù)據(jù)處理為數(shù)字信息。模擬儀器輸出是一個(gè)FCS 2.x文件，它幾乎可以被任何分析軟件包讀取。數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)可以導(dǎo)出為FCS 2.x或3.x文件，一些較舊的分析程序不能解析FCS3.0數(shù)據(jù)。一個(gè)例子是一個(gè)由Joe Trotter編寫的免費(fèi)軟件包，可從 WinMDI下載。它可以在Windows 95和NT上運(yùn)行，網(wǎng)上也有討論它可能可在XP上運(yùn)行。也有一個(gè)為老式Macintosh計(jì)算機(jī)上運(yùn)行SoftWindows編寫的In 80286版本。
不幸的是，即使兩臺(tái)儀器生成同樣的FCS 3.0數(shù)據(jù)，卻并不意味著人們可以自由地分享不同制造商儀器之間的數(shù)據(jù)。通常情況是文本格式的問(wèn)題，可能有一些網(wǎng)上資源可以將一臺(tái)儀器特定格式的文件轉(zhuǎn)換 成另一臺(tái)儀器的。三個(gè)儀器獨(dú)立包可以自動(dòng)或有小的應(yīng)用程序?yàn)橛脩暨@么做。
數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)的優(yōu)勢(shì)是什么？zui重要的是，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)（細(xì)胞）包含相關(guān)數(shù)據(jù)，這樣，如果您將數(shù)據(jù)加載到分析軟件包，包括補(bǔ)償在內(nèi)的幾乎所有參數(shù)可以修改。 FCS 2.x數(shù)據(jù)不能恢復(fù)為預(yù)補(bǔ)償條件，重新分析就受到限制了。
當(dāng)然也有軟件包可以填補(bǔ)現(xiàn)有的分析或演示選項(xiàng)的缺口。其中有兩個(gè)例子，BD Biosciences的CytoPaint ( Leukobyte)和 Paint-A-Gate ，允許進(jìn)行批處理聚類分析和展示/ 另一個(gè)則是 Phoenix Flow Systems它在擴(kuò)增和DNA分析的時(shí)候非常有用。
| 公司 | 軟件 |
| 通用儀器 | |
| Cytobank | Cytobank |
| DeNovo Software | FCS Express |
| TreeStar | FlowJo |
| *儀器 | |
| Cell Sorters | |
| JSAN® / Bay Biosciences® | AppSan |
| BD® / FACS Calibur/Aria | Cellquest / DIVA |
| Beckman Coulter® / MoFlo® | Kaluza / Summit |
| Cytonome® | GigaSort |
| Influx / BD® | Spigot / BD FACS Software |
| Owl / Innovative Micro Technologies | To be determined |
| Partec | FloMax / CyFlow |
| Sony® / iCyt | WinList 3-D |
| Union Biometrica® | COPAS / BioSorter ? VAST |
| Flow Cytometers (analytical) | |
| Accuri®/ BD® | Cflow / BD C6 Software |
| Attune® / Life Technologies® | Attune® Software |
| Apogee | Apogee A-40 Software |
| Guava / Millipore® | GuavaSuite / InCyte |
| Gallios / Beckman Coulter® | Kaluza |
| Stratedigm | CellCap |
| Competing Technologies | |
| Amnis / Millipore | IDEAS |
| DVS Sciences®/CyTOF | 數(shù)據(jù)處理軟件 |
表3。現(xiàn)有的流式細(xì)胞儀軟件
目前，用于分析和數(shù)據(jù)共享好用的免費(fèi)軟件包是Cytobank，上面展示了它的細(xì)胞分揀（FACSelect）功能。對(duì)那些打算研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子運(yùn)行細(xì) 胞內(nèi)流式分析的研究者來(lái)說(shuō)，Cytobank能夠與他們進(jìn)行數(shù)據(jù)共享，F(xiàn)ACSelect就是其中一個(gè)例子。上傳的數(shù)據(jù)是保密的，可以將其標(biāo)記為公開，或 只與特定的合作者共享。這樣，數(shù)據(jù)可以是限制的，*不受限制的，或限制只向同行開放。Cytobank集成了所有*工具：補(bǔ)償、限群、設(shè)置層次結(jié)構(gòu)、 顯示事件子集表、創(chuàng)建等值線圖和熱圖、疊加直方圖。圖4是Cytobank數(shù)據(jù)的熱圖。
Cytobank確實(shí)提供了一個(gè)基于訂閱的高維數(shù)據(jù)集的功能。該軟件被稱為 "SPADE"。
圖 4. 典型的批量分析堆疊直方圖
FlowJo是目前zui常用的流式細(xì)胞數(shù)據(jù)分析軟件包。程序安裝在個(gè)人電腦上，TreeStar可以跟隨目前數(shù)據(jù)分析和演示的趨勢(shì)。 FlowJo site提供了一個(gè)30天的試用版本10（蘋果版是9.6）。這本手冊(cè)有一個(gè)令人印象深刻的新功能列 表。不用說(shuō)，建議在購(gòu)買前先試用一下。圖5是批處理分析產(chǎn)生一系列層疊直方圖。流式細(xì)胞儀會(huì)快速生成大量數(shù)據(jù)。分析大量批處理樣品，然后以一種有意義的方式將它們展示出來(lái)是任何流式細(xì)胞分析軟件包的*能力。
圖 5. DeNovo軟件得出的流式細(xì)胞分析結(jié)果
還有一個(gè)不錯(cuò)的選項(xiàng)是DeNovo 軟件的FCS Express在線數(shù)據(jù)包。一位代表堆疊柱狀圖產(chǎn)生的一個(gè)批次analysisThe的替代方案，也是一個(gè)非常不錯(cuò)的選擇，是在網(wǎng)上包FCS快速?gòu)念^軟 件。它也有一個(gè)令人印象深刻的功能列表，并且還產(chǎn)生了出版物 - Ready圖形。圖6示出了此分析軟件包的功率，并獲得的數(shù)據(jù)時(shí)，在接近瞬時(shí)的鈣的細(xì)胞內(nèi)的波動(dòng)。請(qǐng)注意，X軸是時(shí)間和更迅速的細(xì)胞訊問(wèn)，更有意義的數(shù) 據(jù)。它也有一個(gè)令人印象深刻的新功能列 表，也生成直接用于發(fā)表的圖形。圖6展示了此分析軟件包的強(qiáng)大，對(duì)幾乎瞬時(shí)的細(xì)胞內(nèi)鈣波動(dòng)獲得的數(shù)據(jù)。請(qǐng)注意，X軸是時(shí)間，細(xì)胞檢測(cè)的越快，數(shù)據(jù)越有意義。
請(qǐng)注意，F(xiàn)CS Express已經(jīng)適應(yīng)了它們的圖像分析軟件，這一類型數(shù)據(jù)不斷涌現(xiàn)，因此如果一個(gè)人要從儀器上生成數(shù)據(jù)，必須留心，需匹配軟件的數(shù)據(jù)類型。
FCS從頭分析軟件
總結(jié)軟件部分，流式細(xì)胞儀會(huì)產(chǎn)生海量的數(shù)據(jù)。 導(dǎo)出的FCS標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)能夠直接與不同儀器中的結(jié)果進(jìn)行整合。儀器特異性的和儀器通用的分析軟件包給新用戶的是安全感的假象。要生成大量的數(shù)據(jù)并不難，但如 果我要試圖解釋這些數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)的、收集的和分析的變量卻是無(wú)窮的。要學(xué)習(xí)如何選擇正確的試劑，適當(dāng)?shù)奶幚砑?xì)胞，設(shè)置儀器優(yōu)化您的應(yīng)用程序，補(bǔ)償和運(yùn)行恰 當(dāng)?shù)目刂疲U明數(shù)據(jù)的意義，這些技能的獲得都需要耗費(fèi)時(shí)間。除非你不打算運(yùn)行四個(gè)以上的熒光染料并且所有的染色都是在細(xì)胞表面，跟有經(jīng)驗(yàn)的使用者緊 密合作，能避免所有自學(xué)者犯的常見錯(cuò)誤。如果你打算做細(xì)胞分揀并希望zui后保留活細(xì)胞，這些是尤為重要的。
總結(jié)
請(qǐng)看表I列出的30多種流式細(xì)胞的應(yīng)用。找出zui接近您的研究興趣的一個(gè)，然后在PubMed 或谷歌學(xué)術(shù)上做快速的文獻(xiàn)檢索。確保"cytometry"為關(guān)鍵詞。留心在zui近的幾篇文章中數(shù)據(jù)的展示方式，了解試劑的數(shù)量，所用儀器的復(fù)雜性，以及數(shù) 據(jù)是如何被呈現(xiàn)出來(lái)的。然后回到本文中，看看我界定的新用戶和有經(jīng)驗(yàn)的用戶可能會(huì)面臨的所有潛在風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)流式細(xì)胞儀的分析時(shí)間，試劑（和同種型對(duì)照，補(bǔ)償 珠，以及其他試劑和緩沖液）的成本做出估計(jì)。然后根據(jù)您的特定需要對(duì)其進(jìn)行修訂，安排少數(shù)有經(jīng)驗(yàn)的使用者運(yùn)行程序。這是我希望給那些剛進(jìn)入該領(lǐng)域或者將要 開展從簡(jiǎn)單分析到復(fù)雜多色實(shí)驗(yàn)的使用者推薦的zui低限度的準(zhǔn)備。
參考文獻(xiàn)
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