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近年來，免疫療法作為一種新的癌癥治療方式引起研究者的廣泛關注。在新近開發的癌癥免疫治療技術中，嵌合抗原受體修飾的T細胞（CAR-T）技術備受青睞。從1989年*代CAR-T開發至今，基于CAR-T的癌癥免疫治療取得了重大進展。數十項CAR-T臨床試驗正在范圍內進行（圖1）。為了構建CAR-T，向T細胞內導入編碼識別癌癥抗原單鏈Fv（scFv）的融合蛋白基因，與T細胞受體的細胞內信號傳導結構域相連。
根據T細胞受體的細胞內信號傳導域數目，CAR-Ts分為*代，第二代和第三代（圖2）。*代CAR-T細胞被設計為在細胞外表達scFv，并且T細胞受體胞內信號結構域沒有共刺激分子表達。但*代CAR-Ts通過特異性抗原識別腫瘤細胞后，其對腫瘤細胞的殺傷力不足。為了克服這些缺陷，第二代和第三代CAR-Ts被設計為在細胞內表達共刺激分子（圖2）。第二代CAR-Ts的嵌合抗原受體（CAR）基因框架包含一種共刺激分子，如CD28或4-1BB。第三代CAR-Ts進一步發展為包括CD27，CD28，4-1BB和OX40在內的兩種共刺激分子。
CAR-T的制備和給藥
CAR-Ts通過三個連續步驟制備（Lee et al.2012； Wang and Riviere 2015； Levine 2015）。*步是構建CAR的基因框架，用于編碼與T細胞受體的信號序列連接的腫瘤抗原特異性Fv。第二步，用病毒、非病毒或物理方法將CAR導入T細胞。逆轉錄病毒或慢病毒是成功應用于CAR導入T細胞的病毒載體。也有研究通過電穿孔將編碼CAR的質粒DNA或RNA導入T細胞。第三步是培養CAR-T細胞。
有幾種方法試圖激活T細胞以利于轉染，其中之一是使用抗CD3抗體和細胞因子，如白細胞介素2。其他T細胞激活方法正在研究階段（圖3）。表達4-1BBL和Fc受體的抗原呈遞細胞也被用于激活T細胞。另一種方法使用經抗CD3和抗CD28抗體修飾的珠子進行T細胞活化。CAR-T細胞來源于CD4或CD8 T細胞，使用細胞因子擴增，并通過靜脈回輸給患者。
圖3 T細胞的活化和CAR-T的擴增
CAR-T對比現有免疫療法治療癌癥的優勢
CAR-Ts相較于單克隆抗體和抗體-藥物聯合用藥，其對抗終末期癌癥的有效性引起研究者的廣泛關注。另外，CAR-Ts作用機制與T細胞受體工程T細胞（TCR-T）不同。TCR-T中，TCR識別在APC細胞中加工并與MHC分子共同表達于APC細胞表面的腫瘤抗原復合物。與TCR-T不同，CAR-Ts對腫瘤抗原識別不需要對抗原進行加工和表達，不需要用MHC分子參與（；圖4）。表1總結了CAR-T和TCR-T之間的差異。值得注意的是，缺乏MHC限制意味著適用CAR-T的患者比TCR-T更廣，TCR-T治療需要鑒定患者的MHC類型。
CAR-T研究現狀
CAR-T已經應用于治療淋巴癌和實體腫瘤的多個研究中，涵蓋細胞水平（表2；圖5）、動物水平（表2；圖5）、臨床前（表3；圖5）和臨床研究（表4；圖6）。CAR-T基礎研究階段狀況顯示，在CAR基因導入T細胞時應用逆轉錄病毒載體的。雖然病毒載體的使用占據主導，但陽離子聚合物或電穿孔等非病毒轉染方法已經嘗試過（圖）。淋巴癌等血癌已成為CAR-T基礎研究階段的主要治療目標（圖5b）。第二代CAR-Ts已成為基礎細胞水平和動物水平研究zui廣的領域，主要針對血癌和實體腫瘤（圖5c）。CAR-T應用已經從癌癥免疫治療擴展到自體免疫疾病治療，如歐洲的多發性硬化癥。另一項研究報告指出CAR-T治療真菌感染的新領域。同本研究相似，臨床前研究中，構建第二代CAR和利用逆轉錄病毒載體的頻率均高于其他類型CAR（圖5f）和病毒載體（圖5d）。值得注意的是，血癌臨床前研究低于腦癌（圖5e）。
將CAR-T基因導入T細胞，病毒載體占主導地位。報道稱體內CAR-T存活時間長達幾個月。由于CAR持續表達可引起不良反應，因此*表達時長需要進一步研究。為縮短CAR表達持續時間并降低安全隱患，正在進行物理電穿孔轉染研究。通過電穿孔導入T細胞細胞質的編碼CAR的質粒DNA連續數天表達，可避免轉染載體引起的不良反應。
目前，有超過80個CAR-T項目正在進行臨床研究（www.clinicaltrials.gov）。目前還沒有項目進入Ⅲ期臨床，但鑒于Ⅱ臨床數據（表4），獲準可能性很高。CAR-T的大部分臨床研究在美國進行，部分在中國和日本開展（圖1）。作為CAR-T的腫瘤抗原靶點，CD19被廣泛研究，其在急性淋巴細胞性白血?。ˋLL）患者的白血病細胞表面上超表達。報道稱，CD19 CAR-T對骨髓移植后復發性ALL患兒有效（Lee et al.2015）。臨床研究的產品中，針對ALL的CTL019（Novartis，美國）、CD19靶向CAR-T（CD19-CAR-T）被美國食品和藥物管理局認定為“突破性療法”，正處于Ⅱ臨床階段。其他幾家制藥公司也開發CAR-T產品。臨床研究中，CD19已被廣泛用作血液癌癥的靶抗原（圖6a）。其他靶抗原包括癌胚抗原（CEA）、人表皮生長因子受體2（HER2）、GD2、CD30和CD20（圖6a）。血液癌癥是臨床研究的主要方向（圖6b）。目前為止，Ⅱ臨床是CAR-Ts研究的zui快階段（圖6c）。
挑戰
每一代CAR-T的限制
盡管CAR-T利用了T細胞殺傷異常細胞的免疫反應，但對實體腫瘤細胞的殺傷力較弱。其抗腫瘤活性降低歸因于腫瘤組織微環境的免疫抑制作用，導致CAR-T對實體瘤的滲透效率降低。而且，腫瘤中的白細胞分泌的細胞因子降低了T細胞活性。
第二代CAR-Ts含有的共刺激信號結構域可誘導免疫抑制受體如T細胞膜蛋白-3、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（CTLA-4）和細胞凋亡-1（PD-1）。為了克服PD-1對CAR-T的活性抑制，正在研究抗PD-1抗體與CAR-T聯合使用的效果。一項臨床研究（NCT00586391）正在探索CAR-T和抗CTLA-4抗體ipilimumab聯合使用的效果。
具備兩種共刺激分子如OX40和4-1BB的第三代CAR-Ts在體內活性增強。然而，兩種共刺激分子對T細胞活性的過度刺激可誘導細胞因子分泌的突然增加，稱為“細胞因子釋放綜合征”（CRS）。這種嚴重的不良反應是CAR-T開發過程中需要解決的zui大安全問題之一。
不良反應
CAR-T臨床研究zui大的障礙是其嚴重的不良反應，其中CRSzui為嚴重。接受CAR-T臨床試驗的患者的死亡率突顯臨床方案設計改進的和新藥開發監管的必要性。CRS的癥狀包括高熱、關節疼痛、肌肉疼痛、低血壓和呼吸困難，少數病例死亡。2014年，兩名患者接受Juno Therapeutics公司（美國）CD19-CAR-T治療后兩周內死亡，此項在Memorial Sloan Kettering癌癥中心進行的臨床研究被迫中止。迄今為止，CRS已被確定為臨床試驗中患者死亡的主要原因。
盡管CRS是CAR-T療法zui常見的不良反應，但CRS的進程也被認為與治療作用相關。早期研究發現，對CAR-T治療有反應的患者會發生CRS，而對治療無反應的患者不發生CRS。CRS的嚴重程度與接受CAR-T治療時的腫瘤負荷相關。鑒于CRS在臨床監測中的重要性，需要確定能夠預測CRS嚴重程度的標志物。研究發現，重度CRS中干擾素-γ的峰值水平比在輕度CRS中更高。其他研究提出C反應蛋白可作為嚴重CRS的標志物。然而，CRS的決定性生物標志物仍有待研究。
為盡量減少不良反應，臨床方案設計中甄選患者和優化CAR-T劑量至關重要。目前通過抗白介素-6抗體或類固醇藥物與CAR-T聯合使用以減少CRS，這方面還需要進一步的研究。此外，評估CAR-T是否能誘導自身免疫或移植物排斥宿主等安全性研究也尤為必要。一些研究評估了細胞因子抑制劑或zi殺基因與CAR-T聯合給藥減少CRS的功效。zui近的一項研究報道，CAR-T與抗白細胞介素-6抗體tocilizumab聯合給藥可緩解CRS。
大多數臨床研究使用病毒載體轉染CAR基因，用于CAR-Ts的構建。盡管這些載體被改造為的，但應該對其潛在復制能力進行長期（多年）監測。CAR-T給藥后對細胞因子的分析和標準化是必要的。2014年兩名患者的死亡表明CRS是CAR-T臨床研究中zui嚴重的缺陷。CAR-T細胞體內擴增引起細胞因子過度分泌，并且可能導致死亡。為了監測和控制CRS，確定細胞因子的特定作用和相關細胞因子的類型有助于預測臨床研究中的CRS風險。此外，臨床研究期間細胞因子和CRS標記細胞因子的分析應該標準化。
在CD19-CAR-T案例中，抗癌作用伴有一定程度的不良反應。探索CAR-T療效與不良反應相分離的可能性，旨在建立CRSzui小化的給藥方案。CAR-T的自身免疫是另一個潛在的問題。低劑量的CAR-T和單一CAR-T的系列腫瘤細胞殺傷作用可降低自身免疫發生的可能性。然而，CAR-T的人工構建性質可能增加其自身免疫的風險。因此，為確保安全，對自身免疫問題的監管不應忽視。
除了CRS，另一個值得關心的不良反應是“脫靶”。此類不良反應是由于CAR-Ts的大多數靶抗原共同存在于腫瘤和正常組織上，只是在腫瘤細胞過度表達。為將“脫靶”的不良反應降至zui低，尋找僅在腫瘤細胞表達的新靶分子是必要的。另一種途徑是去除非適當激活的CAR-Ts。zui近的一項研究報道，小分子藥物AP1903可以在轉染的細胞中誘導caspase 9和細胞凋亡，只殺死表達高水平CAR的活化細胞。
監管
美國諾華公司（Novartis）設計的CD19-CAR-T CTL019是*個進入Ⅱ期臨床研究的CAR-T類化合物。從監管角度看，CAR-T制備和臨床研究是主要關注的問題。制備問題包括CAR-T產品的一致性、患者依賴的T細胞轉染效率、適宜CAR轉染的*T細胞類型以及CAR-T標記。臨床研究主要關注效力和安全性。
CAR-T的藥代動力學和生物分布
藥代動力學和生物分布實驗為預測CAR-T可能存在的不良反應提供了必要信息。zui近的一項研究報道，CAR-T經靜脈內給藥后分布到骨髓，在血液中循環中持續存在10個月以上。進一步定量分析藥代動力學、體內組織分布和保留是*的。腫瘤抗原HER-2在腦組織和乳腺中表達；在結腸或正常組織中鑒定出了另一種腫瘤抗原—癌胚抗原；腫瘤抗原在正常組織中的非特異性表達增加了CAR-T對正常組織損傷的可能性。從這些角度看，與CAR-T的分布和藥代動力學相關的監管問題有待解決。
CAR-T效力
與CAR-T效力相關的一個關注點是挑選合適的T細胞亞群。臨床研究中大多數CAR-Ts是從患者全部T細胞中分離導入CAR基因的T細胞獲得。T細胞亞型是否影響CAR-Ts的轉染效率和效力還需進一步研究。
CAR-T效力評估方法需進一步探索。目前CAR-Ts的誘導腫瘤細胞溶解和細胞因子分泌能力處在研究階段。建立評價CAR-T效力的相關方法有助于對CAR-T產品進行標準化評估。此外，由于CAR-T在體內擴增，有必要評估CAR-T占總T細胞的比率、CAR拷貝數和效力之間的相互。
不同于化學藥物或蛋白質藥物，CAR-T是一種活性藥物，給藥后可在體內擴增。這種擴增導致CAR-T的實際有效劑量增加。癥狀嚴重程度和患者年齡可能是影響CAR-T體內擴增效率的因素。給藥劑量和實際發生效用劑量之間存在差異是CAR-T的*特征。進一步分析給藥劑量、效用劑量和治療效果之間的關系是必要的。
需要鑒定出具備抗癌活性的特定T細胞亞型。目前，CAR-T給藥是各種T細胞亞群的混合物。 zui近的一項研究表明，在動物模型中，增加zui接近記憶性T細胞干細胞的CD8（+）CD45RA（+）CCR7（+）的CAR-T比例，抗癌活性增強。
CAR-T的臨床研究
幾個關于CAR-T*劑量的問題需要澄清。由于靜脈輸注的CAR-T在體內擴增，初始劑量與實際發揮效用的劑量不同。另外，劑量的調整標準應該依據患者的體重和體表面積?？紤]到輸注后分布至骨髓的CAR-Ts的擴增，我們需要確定測量所得血液中CAR-T數量是否反映骨髓中CAR-T的擴增。
CAR-T產品的制造和質量控制
為了驗證CAR-T批間質量一致性，藥品制造和控制（CMC）至關重要。對CAR-T生產的每一步實施質量控制十分必要（圖7）。通過質量控制，保持CAR轉染效率的批間一致性，質控參數包括基因修飾的CAR-T占總T細胞比例的可接受范圍和單個細胞CAR基因拷貝數量。為了持續穩定的生產CAR-T，需要提供標準化的轉染和增殖穩定的病毒載體。此外，應該評估患者年齡和用藥史對CAR轉染T細胞的影響。
病毒載體如逆轉錄病毒載體或慢病毒載體經常用于將CAR導入T細胞。應從純度、安全性、T細胞轉染效率和物理化學特性等方面對轉染CAR基因的病毒載體進行質量控制。
此外，質控中CAR-T無菌驗證*。由于CAR-T是由離體T細胞制備的，期間經過CAR基因的導入和擴增，需要建立CAR-T的無菌檢查和微生物限度。
CAR-T的生產和分配需要標準化。經過理論設計和驗證之后，大部分生產工藝從實驗室轉移到生產車間。攜帶CAR的病毒載體和CAR-T的制造過程復雜且在之間存在差異。臨床研究使用的CAR-T產品經不同的生產和分配方案到達患者。基因修飾細胞的生產和分配過程對質量影響至關重要。制造和分配的質量控制和標準化應以實踐為指導。
CAR-T產品的標簽應仔細核對。由于CAR-T的自體性質，CAR基因轉染患者T細胞并將其回輸至同一患者，標識明確對zui小化CAR-T在非自體患者體內擴增的潛在致命風險至關重要。
結論
CAR-Ts作為一種新型且有效的癌癥免疫療法吸引了眾多研究者的關注。制藥公司已經開始投資CAR-Ts，有幾個產品正在審批中。對CAR-T的監管問題也需關注。具備活性的CAR-T需要嚴格評估其安全性和有效性。CAR-T的離體制造過程突出了無菌驗證和全面產品質量控制的重要性。下一步，嚴格監管和制定科學的監管指導方針將會加快開發安全有效CAR-T產品的進程，惠及患者。(生物谷Bioon.com）
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