在生物有機(jī)體內(nèi)，鈣離子傳遞了各種各樣的胞內(nèi)信號，這些信號幾乎在每種類型的細(xì)胞中都存在，而且在很多方面都有非常重要的作用。在很多細(xì)胞活動的時(shí)候，胞內(nèi)鈣離子的濃度會顯著升高。鈣離子成像是利用鈣離子特異染料，將細(xì)胞中的鈣離子濃度通過熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來，從而達(dá)到檢測細(xì)胞活動的目的。德國的科學(xué)家通過研究B細(xì)胞胞質(zhì)中鈣離子濃度來研究 Rho GTPase Rac 對于B細(xì)胞功能的重要影響，研究發(fā)現(xiàn)，RacPLCγ2可以通過增強(qiáng)胞漿內(nèi)的Ca2+濃度來影響B(tài)細(xì)胞受體（BCR）發(fā)揮作用。
文中，研究人員用BCR和Ca2+分別處理DT40 Bcell，觀測DT40B cell中鈣離子的濃度變化。研究人員研究了在這樣的處理下，Unmodified DT40 cells ( PLCγ2+/+), PLCγ2-/- cells，PLCγ2-/- cells stably expressing wild-type 這幾種細(xì)胞的鈣離子濃度變化，說明了PLCγ2，Ca2+和BCR之間的關(guān)系。
圖一：ibidi六通道載玻片，可見載玻片上有六個(gè)平行通道，可以做六組平行實(shí)驗(yàn)?；蛘哂貌煌臉颖?。通道載玻片的特點(diǎn)是單通道容積很小，需要的試劑量只有30μl。其底部可以直接使用油鏡，進(jìn)行高分辨率成像，光學(xué)效果較好。本文中，是使用共聚焦顯微鏡觀測鈣離子染料的熒光值。
一.實(shí)驗(yàn)步驟
1) 使用0.01%（w/v)的多聚L賴氨酸（Poly L-Lysine）對六通道載玻片進(jìn)行包被
2) 單通道鋪入3×105 DT40 B細(xì)胞，37℃,10%CO2環(huán)境中孵育45分鐘待細(xì)胞貼壁。
3) 使用無細(xì)胞培養(yǎng)基，輕輕沖洗通道，移除未貼壁細(xì)胞（圖二）。
圖二：沖洗換液方法，藍(lán)色代表新的無細(xì)胞培養(yǎng)基
4) 用RPMI 1640培養(yǎng)基加入2 µM fluo-4 AM, 0.02 % (v/v)Pluronic® F-127，加入通道中，孵育30分鐘。
5) 用Buffer B沖洗兩次細(xì)胞，可以用加入 BCR抗體 anti-IgM或 1 mM CaCl2做為刺激液。
6) 使用共聚焦顯微鏡觀測數(shù)據(jù)。
一.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
圖三： 由圖中曲線可以看出，在沒有胞外Ca2+存在的時(shí)候，對BCR的刺激（加入 BCR抗體 anti-IgM）和B細(xì)胞中鈣離子活動成比。而當(dāng)有胞外Ca2+的時(shí)候（加入1mM CaCl2）胞外對于胞內(nèi)鈣離子的活動也有非常顯著的影響，會隨著Anti-IgM的升高，胞內(nèi)鈣離子濃度會降低。 |
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